考试医学是医学的紧要组成部分，为临床对疾病迂腐、会诊、调整和预后判断等提供紧要信息。跟着医学技能和医疗诞生的束缚发展，分子会诊学技能在考试医学中的应用越来越粗鄙。分子会诊学是期骗分子生物学表面、技能和方法来讨论东谈主体内源性或外源性生物大分子偏执体系的存在与否偏执结构或抒发调控的变化，为疾病的迂腐、掂量、会诊、调整和转归提供信息和决策依据，从而为个体化医疗提供数据复古。

经过多年的发展，分子会诊学技能主要分为分子杂交技能、PCR技能、以及基因测序技能等。由于分子会诊学技能在疾病会诊方面有快速、准确的优点，其在考试医学中具有紧要隘位。

核酸分子杂交技能是指不同着手的2条核酸单链，在一定条目下，按照碱基互补配对原则造成双链的技能，主要包括荧光原位杂交技能(fluorescence in situ hybridization，FISH)、菌落原位杂交技能、Northern思路法、黑点杂交技能、芯片杂交技能、Southern 思路法等。其中，FISH技能指在东谈主体的染色体､组织或者细胞上，将荧光素符号的探针按照碱基互补配对原则，使得靶基因得以骄矜。

FISH技能自问世以来，被速即应用于检测多样类型的细胞遗传学的更变，包括染色体拷贝数非常、复制、扩增、缺失、倒位和易位等。同期，它亦然临床疾病会诊的紧要技能，如肿瘤检测、对染色体非整倍性非常引起的不孕不育检测等。好意思国医学遗传学学会于1993年发布了应用FISH进行产前会诊的关联证实，FISH技能在我国也应用于临床多年，主要应用于癌症扶持会诊、产前会诊等领域等。FISH技能在产前会诊领域动作核型分析技能的补充已成为众人共鸣。现批准上市居品有HER-2基因扩增检测试剂盒、ALK基因重排检测试剂盒、PML/RARα交融基因检测试剂盒、13/16/18/21/22/X/Y染色体数量检测试剂盒等。

基因芯片是期骗原位合成或者显微点样技能，将好多DNA探针按照法令固定在复古物的名义，然后与进行符号的样本进行杂交，而况将杂交后获取的信号进行分析，从而大要获取样品的基因罗列法令和基因抒发等信息。凭据不同的基因芯片制作方法，基因芯片不错被分为两大类，一类是原位合成的芯片，另一类是DNA微阵列。凭据基因芯片上探针的种类的不同，基因芯片还不错称作是寡核苷酸芯片､cDNA芯片､DNA芯片等。具有高密度性格的寡核苷酸芯片，主要取舍的方法便是原位合成，具有低密度性格的芯片取舍的是点样方法，而cDNA芯片和DNA芯片只可取舍点样的方法制成。由于基因芯片技能具有自动化程度高､操作疏漏､通量高档特质，在基因分型､基因抒发､单核苷酸多态性检测等方面均有粗鄙应用。现批准上市居品有葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变检测试剂盒(基因芯片法)、东谈主乳头瘤病毒分型检测试剂盒（基因芯片法）、东谈主乳头瘤病毒（20个型）基因分型检测试剂盒（PCR-电化学基因芯片法）、电化学基因芯片检测仪等。

团聚酶链式反映 (Polymerase Chain Reaction，PCR)，所以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片断的一种方法，包括变性-退火-蔓延三个基本反映形态。PCR技能由于具有速率快､操作方便､机灵度高､标本要求低以及特异性高档特质，在食物考试､医学､农学等领域均得到粗鄙应用。跟着技能的发展，除通例团聚酶链反映技能外，PCR技能仍是繁衍出好多不同的细分技能，举例及时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR) 、逆转录PCR（Reverse transcription PCR（RT-PCR）、逆转录及时荧光定量PCR（Real-time quantitative RT-PCR，real-time RT-PCR（或RT-qPCR））、数字PCR( digitalPCR，dPCR) 、多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）也称复合PCR、反向PCR（Inverse-PCR）等；恒温扩增的技能还不错细分好多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。

按照PCR技能的演进，东谈主们习尚性的将PCR技能分手为三代：普通PCR技能，及时荧光定量PCR技能（qPCR）和数字PCR技能（dPCR）。普通PCR技能是经典方法，海外和国内门径都全；仪器试剂资本较低，用于定性分析；qPCR技能具有方法熟习，配套仪器试剂都全，试剂资本中等，操作疏漏，检测敏锐性高，特异性高，可杀青半定量检测；dPCR技能不错杀青完全定量，具有更高的敏锐性和特异性，不错检测低拷贝样品，但dPCR技能所用到的仪器诞生和试剂不菲，操作复杂，检测时间长。目下三代的PCR技能各有各的优弱点，也各有各的应用领域，并不是一代取代一代的干系。技能的束缚高出给PCR技能注入了新的活力，使其能解锁一个又一个的应用标的，使核酸检测更方便、更准确。

PCR技能在临床检测中主要用于癌基因的检测和会诊及用药提醒、致病病原体的检测、遗传病的产前会诊等方面。PCR技能在临床检测中被粗鄙应用，技能膨胀性强。现批准上市居品有东谈主乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型试剂盒（PCR毛细电泳片断分析法）、东谈主SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒(PCR荧光法)、α-地中海贫血基因检测试剂盒（Gap-PCR法）、耳聋易感基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）、KRAS基因突变检测试剂盒(TaqMan熔化弧线荧光PCR法)、东谈主Y染色体AZF区微缺失核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）、淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体检测试剂盒（PCR+膜杂交法）、淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体检测试剂盒（PCR+膜杂交法）、MTHFR C677T基因检测试剂盒（PCR-金磁微粒层析法）、东谈主类EGFR突变基因检测试剂盒（多重荧光PCR法）、BMPR1A/PLAC8基因甲基化检测试剂盒（数字PCR法）等。

基因测序便是通过多样测序技能把基因的序列测出来，进而通过生物信息学分析对这些不同的序列进行解读，1977年由Sanger发明的DNA双脱氧链结尾拆开测序法，也被称作“Sanger法”，这便是第一代基因测序技能，早在2001年完成的东谈主类基因组框图，取舍的便是该方法。该技能直到目下依然被粗鄙使用，关联词其一次只可获取一条长度在700～1000个碱基的序列，无法知足当代科学发展对生物基因序列获取的伏击需求。经过束缚的技能开采和校阅，以Roche公司的454技能、illumina公司的Solexa和Hiseq技能及ABI公司的Solid技能为符号的第二代测序技能出生了。第二代测序技能也称高通量测序(high-throughputsequencing，HTS)技能，也被称为新一代测序 (Next Generation Sequencing, NGS)，是临床检测的主力军，相干于一代测序，它不错杀青大界限平行测序，其具备检测用时短､机灵度高､通量高､经济等诸多上风，极地面推动了分子会诊在临床检测方面的应用，也股东了基因组学的发展。第三代测序技能主要所以单分子测序及纳米孔测序为代表，如牛津大学的纳米测序技能(Oxford Nanopore' s nanopore sequencing)，Pacific Biosciences公司的单分子及时技能(Single molecule real time, SMRT)等。与前两代比拟，第三代测序技能的最大特质便是单分子测序，测序经过无需进行PCR扩增。

目下，临床用第二代测序技能（NGS）仍是买卖化，并逐渐走向熟习，国表里许多公司正积极开采和买卖化更多临床本质室的应用居品。NGS在临床应用中的仪器诞生复杂，检测试剂需要凭据不同检测方法配制，操作技能难度较大，对操作主谈主员技能才能要求高，对成果解说的临床水平要求也绝顶高。第三代测序较第二代测序将读长提高了万倍，需克服无理率、资本及样本要求较高以及算法、软件、数据库等配套的技能问题。第一代基因测序技能因资本高､通量低而限度了其在临床方面的应用，但由于它的准确率极高，因而被以为是基因测序的“金门径”。改日基因测序技能发展标的：更快的序列获取速率；更准确的碱基识别方式；更长的单条测序序列长度；更节略的测序仪器平台；更便捷的操作经过；更低廉的测序价钱。

基因测序技能是先对基因取舍片断化的方式，并在此基础上构建基因文库，然后将基因文库和载体相交联，与此同期使其扩增，杀青在载体上合成的同期，大要对数量强大的数据进行测序。基因测序技能比年来发展很快，应用日益粗鄙，在临床上主要应用于寻找疾病的候选基因，可用于单基因病、复杂疾病（如糖尿病、痴肥症等）以致癌症致病基因或易感基因的寻找。同期，极地面促进了胎儿游离DNA的本质室讨论和无创性产前基因会诊的发展。现批准上市的居品有：东谈主类9基因突变纠合检测试剂盒（可逆结尾拆开测序法）、呼吸谈病原体核酸检测试剂盒（可逆结尾拆开测序法）、染色体非整倍体检测试剂盒（纠合探针锚定团聚测序法）、基因测序仪等。

20世纪80年代出现的基质扶持激光解吸电离翱游时间质谱(MALDI-TOF MS)冲破了以往质谱仅可进行小分子物资分析的传统，使得核酸、卵白质等生物大分子也可应用质谱进行讨论，极大股东了基因组学、卵白质组学的发展，而况给生物领域及医学领域带来了立异性的突破。核酸质谱，顾名想义是一种能检测核酸的质谱技能，它是基于MALDI-TOF MS质谱发展起来的一种多重PCR分析检测系统。

质谱仪的中枢组成部分主要包括进样系统、离子源、质地分析器与检测器。质谱仪器平台固然种类宽敞，但不错通过样品进样方式、离子源、质地分析器等方面进行肤浅分类。质谱技能的基痛快趣是通过样品离子化，产生不同质荷比的离子，然后再经过质地分析器测定该样品中不同种类离子的分子量，并按照从小到大的法令标准罗列从而得到一幅质地图谱。由于核酸为极性、非易失性和热不相识的生物大分子，且基于通量要乞降样品制备的难度，目下核酸质谱主要使用的质谱技能为基质扶持激光解吸电离翱游时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionzation Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS），其中MALDI为基质扶持激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization）的缩写，是一种软电离方式的离子源，给样品能量较小，容易获取能指明相对分子质地的准分子离子，基本不产生碎屑峰；TOF-MS为翱游时间分析器（time of flight analyzer, TOF analyzer）其作用为将离子源产生的离子按m/z法令分开比肩列成谱。

核酸质谱技能具有精确度高、特异性高、机灵度高档特质，资本经济且高通量，可杀青一次本质检测多个决议，既具有PCR技能的高敏锐性、模板浓度要求低特质，又具备高分辨率和阵列技能的高通量等特质，且平直期骗质谱峰值定性定量测定，无需化学发光、荧光法或其他任何二级符号方法，合乎临床应用上的通量和机灵度的需求。核酸质谱妥贴于复杂的、多靶标疾病的分子会诊，可应用于药物基因组学、病原体检测等领域。

核酸质谱的主要特质是：PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异蔓延引物，在SNP位点上，蔓延1个碱基。然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，尔后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光引发，由于基质分子经放射所接收的能量，导致能量集合并速即产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并调度为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加快电场中获取研讨的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中翱游到达检测器。MALDI产生的离子常用翱游时间（Time-of-Flight，TOF）检测器来检测，离子质地越小，就越快到达。表面上讲，唯一翱游管长度富饶，TOF检测器可检测分子的质地数是莫得上限的。现批准上市的居品有：二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（翱游时间质谱法）、东谈主CYP2C19基因分型检测试剂盒(翱游时间质谱法)等。

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌的一种得当性免疫交代系统，其通过体内小RNA对外来核酸进行序列特异性检测和千里默，从而抑遏病毒､质粒等入侵。该系统阐扬功能的经过主要包括得当､抒发和搅扰3个阶段。当病毒初度入侵时，细菌会将一小段病毒DNA整合到本人CRISPR基因的间隔序列中;当该病毒再次入侵时，之前整合的CRISPR转录生成熟习CRISPR序列，即crRNA，在crRNA教悔下，Cas卵白特异性识别并切割外源的基因组变为线性，使得病毒无法进行复制和抒发，最终被细菌体内的酶降解。该气候最早被CRISPR前驱Jennifer Doudna和张锋报谈。CRISPR/Cas系统由两大部分组成: 第一个部分是编码Cas关联卵白质的基因，这些Cas卵白在获取外源基因片断和剪切外源基因上都起着紧要的作用。第二大部分被称为CRISPR array，这个部分中包含了repeat序列和spacer序列，这两种不同的序列是间离隔来的，本着两个repeat序列夹一个spacer序列，Repeat序列在兼并细菌中的碱基组成和长度是相对保守，基本不变的。凭据Cas效应卵白的结构和功能，CRISPR/Cas系统被分为两大类: Class 1 (包含了type I, III, and IV), 和Class 2(包含了type II 和type V和type VI)，在Class 1中, 关于外源基因组的剪切需要一个大的Cas卵白复合物(由不啻一种Cas卵白组成)和教悔RNA，在Class 2中, 关于外源基因的剪切只需要一个单一的剪切卵白,目下基于CRISPR/Cas系统的检测方法包括RNA教悔的靶向识别系统(Cas9)，以及靶向识别触发的附带裂解系统(Cas12和Cas13)。凭据检测旨趣, 可将这些基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技能分为两类: 典型的靶向识别切割和非典型的非特异性反式切割。凭据检测信号的方式主要包括四大类:基于荧光信号及时检测､基于裸眼比色检测､基于电化学检测和基于其他信号检测。其中较常用的为基于荧光信号的检测方法，即在反映体系中使用结尾带有荧光基团和荧光猝灭基团符号的单链DNA或单链RNA诠释基因，当Cas效应卵白和crRNA复合物特异性识别切割成见基因后，会对诠释基因进行非特异性切割，荧光素得以开释从而骄矜成果。准确、快速、便捷、经济一直是IVD开采的成见，但就目下已在临床应用的居品来看，CRISPR技能和传统的熟习PCR比拟还未知晓昭着上风，PCR的最低检出限和检测速率以致不错越过CRISPR。一个新技能需要一定时间的熟习和发展，也需要越来越多的临床应用反馈来校阅，因此，跟着索要技能、等温扩增技能的应用以及更新更好的Cas卵白的发现，CRISPR技能是否能越过传统PCR，是否如发表文件所说的有专属的应用场景还有待不雅察。现批准上市的居品有：新式冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（恒温CRISPR法）、新式冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（CRISPR免疫层析法）等。

微流控(Microfluidics)，是一种精确足下和操控微模范流体，尤其专指亚微米结构的技能，又称其为芯片本质室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片技能。是把生物､化学､医学分析经过的样品制备､反映､分离､检测等基本操作单位集成到一块微米模范的芯片上，自动完身分析全经过。微流控芯片技能应用于核酸分子检测，不错将核酸索要､扩增及检测等基本操作单位集成到一块几正常厘米大小的芯片上，杀青核酸分子的自动化检测。跟着微流控芯片技能在临床考试会诊中的应用和发展，基于核酸分子检测的微流控居品也启动占领了部分商场。Cepheid公司在2005年发布的GeneXpertPCR分析仪，是寰宇上第一个将样品制备､扩增与检测完全整合的定量PCR(团聚酶链式反映)仪，使得不具备专科技能的东谈主员也不错在多样环境下进行复杂的分子检测，同期基于及时荧光定量PCR技能，不错在30min内完成检测。Cepheid公司单个芯片只可进行单个神态的检测，而GenePoc的Revogene系统以及博晖创新的GenPlexTM微流控全自动核酸检测系统将芯片蓄意成离心及阵列式微流控芯片，在单一芯片上不错进行多个神态的检测。现批准上市的居品有：赛沛的结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测试剂盒（及时荧光PCR-熔化弧线法）、博奥晶芯的二十三项遗传性耳聋关联基因检测试剂盒（微流控芯片法）、卡尤迪的新式冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、东方知微的新式冠状病毒（2019-nCoV）及甲/乙型流感病毒核酸纠合检测试剂盒（荧光PCR法）等。

本文前五种检测技能是基于核酸检测方法学的分类，终末一种检测技能时基于流体足下及自动化生成的检测平台新应用。各检测技能在临床应用中都有各有特质，均已在临床成效调度应用。跟着我国东谈主口老龄化的进度，癌症、慢性病等发病率会握续升高，同期国民健康意志也在逐渐提高。分子会诊技能将呈现快速且自动化趋势，以减少东谈主工破钞、编造资本、裁汰检测周期，以便更好地在临床应用。(着手：中国器审)